生殖器皰疹的診斷主要依賴臨床表現(xiàn)。鑒于國內(nèi)各大防治機(jī)構(gòu)實驗室診斷存在不統(tǒng)一，現(xiàn)推薦中國/毆盟項目管理方法如下：簡易的實驗室診斷可通過直接從水皰和潰瘍底部取材作Tzanck試驗檢查(Wright染色或Giemsa染色)檢查，顯微鏡下是否有典型的多核巨細(xì)胞或核內(nèi)病毒包涵體。其它實驗室診斷包括病毒培養(yǎng)、抗原檢查、細(xì)胞學(xué)檢查以及電鏡檢查等方法。培養(yǎng)及電鏡檢查的方法對實驗條件及技術(shù)要求很高，因此目前僅推薦在中心一級的專門實驗室中進(jìn)行。血清學(xué)檢測用于流行病學(xué)調(diào)查及同顧性診斷單純皰疹病毒的原發(fā)感染有一定意義，但方法比較繁瑣，因此不予推薦。

　　1.標(biāo)本收集

　　(1)皰疹：用結(jié)核菌素注射器和26號針頭從成熟的小皰中抽取液體，注入到含有2ml病毒運(yùn)送液f或Ha。k。液)的小瓶中，或者刺破后用棉拭或滌綸拭子取樣，并將拭子頭剪斷放入裝有2ml病毒運(yùn)送液的小瓶中。

　　(2)潰瘍：先將潰瘍表面痂皮或污物去除，再用滌綸拭子擦拭或刮取潰瘍的基底部和未愈合部位.尤其是病損邊緣部位，并將拭子剪入2ml病毒運(yùn)送培養(yǎng)液中或涂片作組織病理染色或直接免疫熒光檢查。

　　(3)宮頸損害：懷疑女性宮頸生殖器皰疹感染時，取材前不要使用任何潤滑劑或消毒劑。用棉拭或刮匙在宮頸可疑損害部位用力擦拭或刮取，送檢，作病毒培養(yǎng)或作抗原檢測。多個部位，如宮頸、陰道、陰唇同時取材比單一部位取材好。24小時內(nèi)接種的標(biāo)本可置4℃冰箱，如當(dāng)天不能接種，應(yīng)置低溫冰箱(一70℃)保存。

　　(4)注意事項：無論是原發(fā)感染還是復(fù)發(fā)感染，從潰瘍開始出現(xiàn)到完全愈合一般需要10～20天時間，病毒釋放的高峰時間在原發(fā)感染為發(fā)病期的8～10天、在復(fù)發(fā)感染為4～6天。因此，取樣應(yīng)盡可能取皰液和潰瘍才能提高培養(yǎng)和涂片檢測的陽性率。

　　2.細(xì)胞學(xué)檢查

　　原發(fā)性生殖器皰疹感染，細(xì)胞學(xué)檢查更易成功，感染早期取材效果較佳。皮膚病損比黏膜處更易獲得陽性結(jié)果。典型的細(xì)胞病理變化為多核巨細(xì)胞，細(xì)胞核多位于周邊，但并不相互重疊，細(xì)胞中央有一嗜伊紅區(qū)。有些細(xì)胞核內(nèi)有包涵體(嗜伊紅)，包涵體周邊有一暈圈。巨細(xì)胞病毒感染及腺病毒感染時，也可產(chǎn)生包涵體.但無多核細(xì)胞。細(xì)胞學(xué)檢查染色的方法如下：

　　(1)采集標(biāo)本后，將取材輕輕涂在一潔凈的載玻片上。

　　(2)固定皮膚黏膜取材，用甲醇固定5分鐘。宮頸部取材，用95％乙醇固定15～60分鐘。

　　(3)染色皮膚黏膜的標(biāo)本，可采用Tzanck涂片檢查法，用姬姆薩染液或姬姆薩一瑞氏染液染5～30分鐘后，用流水輕輕沖洗。待干。宮頸部位的取材，可采用PapanicoLaou染色法。

　　3.抗原檢測

　　直接免疫熒光抗體檢測或免疫熒光試驗(IFA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測HSV抗原。

　　(1)用無菌棉拭用力擦拭水皰或潰瘍的基底部，盡量取得有細(xì)胞的組織液。

　　(2)涂片，室溫干燥。

　　(3)一20℃的丙酮或甲醇固定15分鐘，自然干燥。

　　(4)滴加FITC標(biāo)記的HSV一1或HSV一2單克隆抗體，置濕盒37℃孵育30～45分鐘。

　　(5)用pH7.4的PBS浸洗三次，每次10分鐘，洗去沒有結(jié)合的抗體。然后用蒸餾水清洗15分鐘。干燥后加封片，熒光顯微鏡檢查(在495nm波長下檢測)。

　　(6)結(jié)果觀察陽性結(jié)果時多核細(xì)胞內(nèi)可見到發(fā)蘋果綠色熒光的病毒包涵體。

　　(7)臨床意義如查到病毒包涵體則有助于診斷，此方法敏感性僅為50％～90％。

　　4.病毒培養(yǎng)

　　常用的細(xì)胞有猴腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞、人胚肺成纖維細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和Hep一2細(xì)胞。細(xì)胞長成良好單層備用。培養(yǎng)后用免疫熒光法對培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。

　　(1)準(zhǔn)備單層細(xì)胞：首先將已生長的細(xì)胞系用胰蛋白酶消化，用含10％的胎牛血清的生長培養(yǎng)基制備成每毫升6-8xl04細(xì)胞的混懸液，用1N的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。然后分裝至帶蓋的試管中，每管lml。將試管放人37℃培養(yǎng)2天后，即可長成融合良好的單層細(xì)胞。

　　(2)標(biāo)本接種：接種前吸去單層細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)的培養(yǎng)液，將待檢標(biāo)本搖勻(在病毒運(yùn)送培養(yǎng)液中)，每個待檢標(biāo)本接種1～2管，每個單層細(xì)胞培養(yǎng)管中接種待檢標(biāo)本0.3～0.5ml，37℃孵育1小時，將病毒吸附到細(xì)胞上做2個楞胞培養(yǎng)。加入含2％胎牛血清的培養(yǎng)基，37℃孵箱培養(yǎng)。對于陰道、尿道以及腦積液標(biāo)本，應(yīng)每隔24小時更換培養(yǎng)基。

　　(注：所有待檢標(biāo)本均應(yīng)保留部分標(biāo)本，以便在培養(yǎng)污染或操作失誤時備用)

　　(3)培養(yǎng)及觀察細(xì)胞變化，應(yīng)觀察細(xì)胞變化：75％的培養(yǎng)物典型的細(xì)胞病變(CPE)在2天內(nèi)出現(xiàn)，出現(xiàn)的快慢取決于標(biāo)本中病毒的含量和毒力。病變表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒，細(xì)胞腫脹、氣球樣變，有巨細(xì)胞或融合細(xì)胞出現(xiàn)。完整的單層細(xì)胞層中間出現(xiàn)無細(xì)胞生長的空白區(qū)域，細(xì)胞變得不連續(xù)。陰性結(jié)果應(yīng)觀察至第5天方可判斷為培養(yǎng)陰性。

　　(4)傳代：至少50％以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，收集培養(yǎng)物，再次接種新鮮傳代細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)至50％細(xì)胞出現(xiàn)CPE時將感染細(xì)胞用吸管吹下來，以2009離心10分鐘，棄上清，用含2％的胎牛血清的1mLpH7.2的PBS將細(xì)胞混懸。

　　(5)檢測：取251xL細(xì)胞懸液滴于載玻片上，按常規(guī)lmlpH7.2方法制成涂片、空氣干燥，丙酮固定。用熒光標(biāo)記的單抗，以直接或間接免疫熒光染色分析，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

　　(6)結(jié)果觀察：以熒光標(biāo)記的單克隆抗體對固定后的細(xì)胞染色，鏡檢時如病毒培養(yǎng)陽性，則細(xì)胞發(fā)出蘋果綠色熒光;病毒培養(yǎng)陰性，則細(xì)胞復(fù)染成橙紅或暗紅，不帶任何熒光。

　　(7)臨床意義：病毒培養(yǎng)為HSV檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對病毒分離敏感、特異。根據(jù)典型的細(xì)胞病變特征即可初步報告為“HSV分離可疑”，當(dāng)用染色或直接免疫熒光抗體檢測證實后可報告“HSV培養(yǎng)陽性“。

　　(8)注意事項：①病毒對不同細(xì)胞的敏感性不同，因此應(yīng)選擇敏感細(xì)胞進(jìn)行病毒培養(yǎng)，而且細(xì)胞應(yīng)是生活力強(qiáng)的幼齡細(xì)胞。②標(biāo)本收集后應(yīng)盡快接種，不能在當(dāng)天接種的標(biāo)本應(yīng)保存于一70％低溫冰箱。③培養(yǎng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE，并非HSV感染的特有的現(xiàn)象，例如CMV、水痘一帶狀皰疹病毒等病毒培養(yǎng)中，可出現(xiàn)同樣的病變，但通過臨床癥狀、選用不同的細(xì)胞系培養(yǎng)，即可加以區(qū)分，如Hsv可在Hela、BHK、兔腎細(xì)胞中生長，而CMV卻不能在這些細(xì)胞中生長。

　　5.標(biāo)本運(yùn)送

　　取樣后的標(biāo)本若不能立即進(jìn)行檢查，盡可能地將標(biāo)本洗進(jìn)運(yùn)送液中，棄去拭子，置冰浴送檢。

　　6.標(biāo)本保存

　　標(biāo)本洗于運(yùn)送液中，置于一70℃冰箱保存。

　　7.血清學(xué)方法

　　標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)體結(jié)合技術(shù)不能區(qū)別HSV一1和HSV一2抗體，但更特異的方法如用HSV—l糖蛋白和HSV一2糖蛋白以酶免疫或放射免疫測定，可以區(qū)分HSV一1和HSV一2抗體。血清學(xué)方法可用于血清流行病學(xué)調(diào)查，估計人群的感染，但不能用作臨床診斷。HSV抗體滴度由陰性變?yōu)殛栃詴r可證明HSV的原發(fā)感染，但在復(fù)發(fā)時血清抗體滴度并不升高。