熱休克蛋白（Hsps）是細胞在一些應激條件，如熱休克、葡萄糖饑餓或受到病原菌感染時有高效表達的一族蛋白。Hsps有高度的保守性，在不同的菌株中同族的Hsps有很高的序列同源性，而不同族的Hsps之間卻無明顯的同源性，如Hsp60s和Hsp70s。熱休克蛋白不僅在應激條件下有高效表達，而且在正常的生理條侏下，許多熱休克蛋白也有組成型表達。它們參與一些重要的細胞生理活動，如蛋白質轉位、拆疊和裝配，因此又被稱為“分子伴侶”。大多數熱休克蛋白在正常和應激條件都具有識別非天然蛋白的能力，在受到熱休克或暴露于其他形式的環境壓力時，許多細胞內蛋白會發生部分或全部變性，此時Hsps可識別暴露于變性蛋白表面的疏水性區域，協助它們進行重新折疊，或者將無法恢復的蛋白質轉移給蛋白質降解系統，使之降解，從而可避免細胞進一步受到傷害，因此Hsps對細胞具有保護作用。除此以外，在受到感染和發生自身免疫性疾病時，Hsps可作為一重要的抗原被免疫系統識別，因此其在醫學方面的作用也日益受到重視。

　　1 熱體克蛋白——蛋白質生物合成過程中的分子伴侶[1]

 　　在過去幾年中，對熱休克蛋白在細胞生理活動中的重要作用已有了更深入的了解。它們直接參與了從初生鏈合成到多亞基復合體裝配的整個蛋白質生物合成的過程，因此，又被稱為“分子伴侶”。目前分子伴侶是泛指參與介導多肽的正確折疊和裝配的一類蛋白伴侶的功能主要有兩方面，一方面阻斷非生產性的蛋白之間的相互作用；另一方面則可把正在折疊的蛋白與其他的蛋白隔離開，使蛋白處于一有利于折疊的狀態。因此它們對于生命來說是必需的。大多數分子伴侶是熱休克蛋白，如Hsp70s、Hsp60s、Hsp90s、Hsp15-30s和Hsp100s。

　　其他的有伴侶功能的蛋白，如SecB和PapD,主要調節特定的蛋白質的折疊、定位和裝配反應，所以最主要的還是熱休克蛋白。

　　1.1 Hsp70s

　　Hsp70s在所有真核細胞的腔室中以及至今檢測過的所有細菌中都存在，且高度保守。不同來源的Hsp70s有相似的生化特性，都具有高親和力的ATP結合位點的肽結合位點，Hsp70s可識別非天然和未折疊的蛋白，但它們對處于折疊狀態的蛋白卻幾乎無識別能力。這說明Hsp70s與蛋白的結合是依賴于對未折疊狀態的識別，而不是對特定序列的識別。Flynn等證明8～25個殘基的肽段可以結合到細胞質的Hsp70s族Hsc蛋白和內質網的BiP上，并可刺激它們的ATPase活性。Hsp70s與初生蛋白結合主要是為了防止在合成過程中蛋白質發生成熟前的錯誤折疊和凝聚，并且使新合成的肽鏈處于一松散構象狀態，以利于進一步的折疊或移位過程的進行。

　　1.1.1 E.coli DnaK DnaK最初是作為λ噬菌體DNA在E.coli中復制所需的一種宿主基因的產物而為人們所認識的。它在正常的細胞生理活動中也有非常重要的作用。DnaK基因突變會導致 e.coli的溫度敏感生長。 E.coli的合成會因胞內變性蛋白的積累而增加。1988年Clarke等發現DnaK可與在E.coli中表達的外源真核蛋白結合，Phillips等在1990年則發現DnaK的過量表達有助于lacZ雜合蛋白穿過細胞的內膜運往胞外。這些觀察都表明DnaK在調節胞內蛋白與蛋白之間的相互作用方面有重要作用。在噬菌體復制時， dnaK與其他兩種熱休克蛋白DnaJ和GrpE協同作用，參與該過程，而且它還可與DnaJ共同作用活化與質粒P1復制有關的起始蛋白RepA。在這兩個過程中DnaK的作用是依賴于ATP的，而且DnaJ和GrpE的存在對它的功能也是必需的。體外實驗已證明，DnaK的活性在DnaJ和GrpE存在時可提高50倍。此外，DnaK可保護酶在體外時免受熱失活。這種保護作用不需ATP；另一方面，DnaK也能通過溶解高溫下形成的聚合體，使熱失活的聚合酶重新恢復活性，這一過程則依賴于ATP水解反應。Pierpaoli[2]等應用熒光光譜分析研究了E.coli中DnaK/DnaJ/GrpE系統與肽結合、釋放的作用過程，基本過程如下：（1）ATP水解，并使DnaK構象發生改變，這種狀態與GrpE和肽的結合能力比較弱，但與DnaJ卻有很強的結合力；（2）DnaJ與DnaK結合后，可使DnaK的構象發生變化，從而有利于其與肽發生結合，這一反應雖然速度較慢，但DnaK與肽的親和力卻非常高；（3）在DnaJ的作用下，DnaK恢復成原來的構象狀態；（4）肽從復合物上脫離。過去認為DnaK僅與一引起疏水性氨基酸如Ile、 leu、 Ala有作用，但是最近發現DnaK上也有親水性氨基酸Lys和 arg的結合位點，而且當其疏水性氨基酸結合位點被占據以后，DnaK與Lys和Arg的結合能力會隨之增強。

　　1.1.2 酵母中的HsP70s 酵母中有八種HsP70s，其中Ssclp位于線粒體基質中，Kar2p位于內質網腔中，其余六種位于胞質中。

　　1.1.2.1 Ssclp 它和E.coli中的DnaK最為接近，這與內共生假說一致。基因破壞實驗說明Ssclp對所有生長條件下的細胞都是必需的。若Ssclp失活則會導致線粒體的蛋白質運輸發生障礙，說明Ssclp在進入線粒體中的蛋白的膜轉位和折疊過程中起重要作用。

　　1.1.2.2 Kar2p Kar2p參與蛋白進入內質網的轉位作用，它與Ssclp功能相似，哺乳動物細胞中在內質網定位的HsP70s又稱為BiP，它可與未裝配的免疫球蛋白重鏈分子結合，而對免疫球蛋白無結合能力，說明BiP在蛋白質裝配過程中有重要的作用。又因它也是一種葡萄糖調節蛋白，所以又被稱為Grp78。它與酵母中的Kar2p一樣，也可被各種應激條件所誘導，如葡萄糖限制，分泌前體的積累等，它們可使已合成的蛋白處于一松散狀態直至其他亞基合成完畢才裝配形成復合體，并且可把異常蛋白運輸到內質網降解系統，使之降解，以免對細胞造成進一步的損害。

　　1.1.2.3 胞質中的HsP70s 它屬于ssA和ssB兩個亞族，其中ssA亞族包括四種蛋白，其表達受熱休克誘導，而屬于ssB亞族的兩種蛋白卻在熱休克時關閉。ssA亞族對于酵母來說是必需的。體外實驗證明，ssA亞族對蛋白進入內質網和線粒體的蛋白轉位及發生正確折疊有重要的作用。添加ssA可使轉位作用加強，推測它們可能是通過使未折疊前體處于一松散的有利于轉位的狀態而起作用。

　　1.1.3 哺乳動物胞質中的Hsp70s 在哺乳動物細胞中發現了一類廣泛存在的熱休克蛋白--Hsp110，它屬于HsP70s的一個亞族。體外熱變性實驗和重新折疊分析表明，Hsp110在選擇性地識別變性蛋白和使它們維持一可溶性的折疊感受態方面，比Hsp70更為有效。因而Hsp110是哺乳動物細胞內很重要的一種分子伴侶，它是細胞保護和修復變性蛋白的一個重要工具。

　　1.2 Hsp60s 又稱為 Chaperones60(Cpn60)。所有的Hsp60s除了一級結構相似以外，它們的二級結構也都是由兩個各含有七個亞基的環所組成。體外和體內實驗都已證明，Hsp60s可與未折疊蛋白結合，并且可降低折疊時的能量障礙或降低中間物對凝聚的敏感性。除此以外，Hsp60s還協助某些蛋白，如細胞色素從基質到線粒體內膜空間的運輸。

　　1.2.1 GroEL GroE蛋白是E.coli中主要的熱休克蛋白之一，它包括65kDa的GroEL與15kDa groES兩種蛋白質。其中GroEL與真核細胞中的 Hsp60s有很強的同源性，它與GroES共同協助蛋白質的折疊和裝配過程。基因缺失實驗表明[3]groEL和groES對細胞在任何溫度下的生長都是必需的。groEL或groES突變會降低DNA和RNA的合成速度，而且在非允許溫度下細胞不能進行正常的分裂。GroE蛋白在E.coli的噬菌體形成過程中也有作用。GroEL和GroES的過量產生可通過促進突變蛋白的正確折疊或裝配來抑制許多基因的溫度敏感突變。

　　早期在E.coli中表達真核蛋白時，發現異源蛋白在E.coli中合成的量比較理想，但由于它們在細菌中易形成包含體，阻礙了它們進一步發生正確折疊，而使這些蛋白無法運輸到胞外。為解決這一難題，過去常用尿素溶解這些包含體，然后再在體外還原，這樣處理之后得到的蛋白量就很少了。實驗發現，GroEL和GroES的過量表達可以防止包含體的形成因此將來GroE過量生產菌在提高細菌中外源蛋白的生產方面是很有前途的。

　　1.2.2 最近在不同的生物體的線粒體中都發現了Hsp60s，它們在熱休條件下，可占到細胞總量的1%。酵母線粒體中的Hsp60s是由核MIF4基因編碼的。該蛋白質的氨基端有一線粒體定向的序列。這段序列在其進入線粒體后即被切除。Hsp60s可以裝配成由兩個各帶有7個亞基的圓環壓縮而成的聚合體。這個過程可能由功能性的Hsp60s自身來完成。mif4基因的突變是一致死性突變，這種突變體可以進行蛋白質的運輸，但在進入線粒體后，不能進行正確的折疊和裝配。最近，在真核細胞的胞質中發現了一種TCP1復合物，實驗證明它與在細菌、酵母和真核細胞器中發現的Hsp60s有較強的同源性。而且Liang[4]等還發現胞質中的這種Hsp60s可參與細胞骨加架蛋白如微管蛋白、肌動蛋白的合成。并且TCP1復合物是一中心體組分，因而很明顯參與了微管的核化過程。其他的分子伴侶，如Hsp60s、Hsp90s和smHsp在形成和保護細胞骨架方面也有非常重要的作用。

　　Hsp70s和Hsp60s都廣泛存在于細菌和真核生物的線粒體和葉綠體中，但它們是相對獨立的。在線粒體中，Hsp70s在蛋白轉位之前與之結合，Hsp60s則在稍后的階段加入。有趣的是，NMR研究發現與DnaK結合的肽段處于一伸展狀態。而與GroEL結合的肽則處于一α螺旋狀態。而且兩種蛋白在蛋白質折疊過程中的作用也不相同。這種不同是由于它們寡聚體狀態的不同造成的。

　　1.3 Hsp90s[5]

　　Hsp90s同Hsp70s一樣，在細菌、酵母和哺乳動物中是高度保守的。Hsp90s是一類主要存在于細胞質中的蛋白質。在酵母中主要有兩類Hsp90s：HSC82和HSP82，其中HSC82為一組成型表達的蛋白質，而HSP82是受熱休克誘導中，在熱休克時，其表達量可提高10～15倍。如果這兩個基因中的一個失活，則細胞不能在高于37.5℃下生長,若全部失活則細胞不能生存.目前對哺乳動物細胞中存在的Hsp90s也已進行了深入的研究.這些研究表明,Hsp90s的二聚體與一些蛋白,如Tyr激酶和固醇激素受體有關，因此推測Hsp90s在細胞中通過空間干擾作用阻礙這些蛋白質活性的表達，而且使這些蛋白處于未折疊狀態直至其正確定位完成。1989年Bresnick在體外研究糖皮質激素時發現Hsp90s的結合對于糖皮質激素的結合是一必要條件，因為當激素與其受體結合后，Hsp90s即從受體上脫離下來，這促使受體從一非DNA結合狀態轉變成一DNA結合狀態。1996年Freitag等在粗糙鏈孢菌中發現了一種Hsp80蛋白，這種蛋白是該菌在熱休克和碳源饑餓時合成最多的一類熱休克蛋白。分析編碼該蛋白的基因發現，它與真核細胞中的Hsp90s成員有很明顯的序列同源性。通過基因缺失實驗發現在該Hsp90s和Hsp70s的功能有重疊，任一基因的單獨缺失都不會導致細胞熱抗性的消失。而在真核細胞中，至今未發現這種功能重疊現象。生化實驗表明，Hsp90s的協助下，變性的檸檬酸合成酶和單克隆抗體的Fab段可重新發生正確折疊。過去對于Hsp90s的分子伴侶活性是否是ATP依賴的問題，一直沒有定論，1996年Jokob等[6]用Hsc70和免疫球蛋白作為對照，證實了Hsp90s是不依賴于ATP的。實驗證實，Hsp90s不與固定化的ATP結合，也不能特異性地與azino-ATP發生光交聯反應，也不與三種熒光ADP類似物結合。這些特性均與人們已知的ATP-independent的免疫球蛋白一致而與ATP-dependent的Hsc70完全不同。而且Hsp90的氨基酸序列也與已知的ATP結合類似物不同，由此可斷定高度純化的Hsp90s是不結合ATP的。而以往有人觀察到的Hsp90s與ATP有微弱的結合活性則可能是由于其純度不高或是由某些與Hsp90s結合的激酶造成的。

　　1.4 smHsp

　　除了以上三類熱休克蛋白外,還有一類小分子的具有伴侶功能的熱休克蛋白,稱其為smHsp.smHsp的作用主要是有效地捕捉未折疊蛋白,并使之處于一有利于折疊的感受態,然后與其他熱休克蛋白共同作用,使之進行有效的折疊。在E.coli中的GroES是非常典型的smHsp，它與GroEL協同作用，參與胞內蛋白質折疊過程。在真核細胞中smHsp除了可阻止蛋白質的不可逆凝聚外，它在正常生理條件下的表達水平還與細胞壁的生長分化有關。1989年Gaestel等發現穩定期的腫瘤細胞中smHsp有高活性表達，而且在分化過程中其表達水平也明顯提高。Knauf等認為smHsp的過量表達不僅可以提高細胞的耐熱性，而且還可以特異性地抑制細胞繁殖。最近幾年研究發現[7]，人的α-晶狀體與smHsp有很強的同源性，結構研究發現它們都易形成大的寡聚體，而且Leroux已證明這種寡聚體對于smHsp與未折疊蛋白的結合是必需的。Norris在研究魚的熱休克反應時發現，smHsp往往是在其他熱休克蛋白的合成降低時才開始。

　　1.5 其他的熱休克蛋白

　　當溫度突然升高或一個正常的細胞過程發生障礙時，胞內會出現許多未折疊或無功能的蛋白質。這些蛋白質有現兩種命運：一是在分子伴侶的協助下恢復它們的天然構象，如E.coli中DnaK能使變性的RNA聚合酶重新恢復構象；二是作為細胞中的垃圾被蛋白酶降解。Hsp104就是E.coli中與蛋白質水解有關的一族熱休克蛋白。它由clpA和clpB兩種蛋白質組成。其中clpA自身無蛋白酶活性，但具有ATPase活性，所以它可能通過調節蛋白酶clpP的活性來影響蛋白質的降解。

　　泛肽介導的蛋白質水解是真核細胞中蛋白質降解的主要途徑。泛肽也是一種熱休克蛋白，在進化上有高度保守性，而且在細胞中蛋白酶都是熱休克蛋白，它們直接參與水解作用，而且在饑餓條件下也有多種熱休克蛋白的產生。它們可增加細胞對饑餓的抗性，是細胞自我挽救時的必要措施。

　　2 熱休克蛋白表達的調節[8]

　　最近幾年對于熱休克蛋白的功能和調節機制有了更深的了解。大多數的熱休克蛋白在正常的生理條件下也可產生，雖然量比較低，但在細胞的生理活動中有著非常重要的作用。當細胞暴露于較高的溫度時，一套熱休克蛋白會迅速地暫時地誘導出來，以應付高溫對蛋白質的破壞，這種誘導作用通常發生在轉錄水平。它們的轉錄因一些特異性轉錄因子量的增加而增強。這種特異性轉錄因子在所有生物中普遍存在。在E.coli中為σ32，在真核中為HSF。一些熱休克蛋白，如Hsp70s在誘導產生后，又可對熱休克蛋白的合成起反饋調節作用。

　　象其也生物一樣，在E.coli中熱休克蛋白的暫時誘導是細胞一個非常明顯的應激變化。當細胞受到一個比較溫和的熱休克時，如從30℃轉移至42℃，除有些蛋白暫時降低產量外，大多數蛋白不改變它們的合成速率。熱休克蛋白的誘導則幾乎是在受到熱休克后立即發生，在5分鐘內達到最高值，并且在20～30分鐘內降到一新的穩態水平。當細胞置于一致死溫度時，如50℃則大多數蛋白停止合成，此時細胞內存在的蛋白質多為熱休克蛋白。

　　熱休克蛋白調節機制研究的一個重要突破是在1975年Cooper和Rueffingher利用一影響高溫下蛋白質合成的無義突變株得到的。他們發現在E.coli中存在一種含量很低的32kDa蛋白質σ32。由它參與構成的RNA酶全酶能識別熱休克基因的啟動子，這類啟動子與標準的σ因子所識別的啟動子有所不同。在其-35序列前有幾個保守殘基，在-10序列前有保守的CCCC片段。編碼σ32的基因為rpoH,rpoH的突變阻止了熱休克蛋白合成的暫時增加，而且實驗證明，Hsps的誘導依賴于ropH基因產物合成的量。另外，ropD（編碼標準σ因子的基因）的琥珀突變可明顯增加熱休克蛋白的合成量，這表明rpoH的基因產物σ32可能與標準的σ因子競爭RNA聚合酶核心酶。在穩定生長時，每個細胞只有10～30個σ32因子，這是因為σ32是一種極不穩定的蛋白質，其半衰期很短，為1分鐘左右，并且它的合成在翻譯水平上受到很大的限制。因此正常生長條件下細胞內σ32的濃度很低。當溫度從30℃升高到42℃時，σ32在最初的4～5分鐘內穩定性增強，從而可快速積累。然而，這一階段后，σ32又重新不穩定，這與觀察到的σ32的暫時增加一致。

　　DnaK是第一個報道的熱休克蛋白的負調節因子，因為dnaK突變株可導致低溫下熱休克蛋白的水平升高，并且可延長高溫時熱休克蛋白的合成時間，從而使其總量增加。其他的，如dnaj、grpE的突變都可導致相同的表型。在這些突變株中σ32的穩定性比野生型有明顯的提高，其半衰期延長10～30倍。而且因為這幾種熱休克蛋白都不是蛋白酶，所以，推測他們可能直接與σ32結合，然后把它轉移給一個蛋白質降解系統使之降解。實驗發現E.coli被λ噬菌體侵染后可表達高水平的熱休克蛋白，因為λⅢ蛋白可能對σ32的穩定性有增強作用，從而使熱休克蛋白的量有所增加。

　　3 應用

　　當細胞受到熱休克，或暴露于其也形式的壓力條件下時，胞內許多蛋白會發生部分或全部的變性，而熱休克蛋白可識別變性蛋白表面的疏水區域，加速它們的重新折疊，并防止不可逆的凝聚反應發生，這種能力說明了熱休克蛋白在細胞受到損傷時可有效地保護細胞。大量研究證實，細胞在正常致死溫度下存活的能力與熱休克蛋白的積累有關，如體溫升高會引起Hsp70s的表達的增加，或導致它們在某些細胞類型中過量表達，從而增強細胞對TNF-α引起的毒性效應的抗性，而且已經證實Hsp70s的過量表達可提高紫外線照射后細胞的存活率。大量的體外模型系統正在研究將Hsps用于移植過程中器官的保護以及保護組織免受缺血和神經傷害[9]。由于Hsps具有分子伴侶活性，因而其在蛋白質工程方面的作用早已引起人們的重視。Ryan等發現在熱休克條件下進行先期誘導培養，對于在E.coli中人的重組蛋白的表達和其轉譯后修飾有非常重要的作用。翻譯后修飾的程度與特定的熱休克蛋白的濃度有關，而且實驗發現不僅重組蛋白的表達加強，這些蛋白的同質性也有提高，從而有利于后處理過程的進行[10]。

　　另外，熱休克蛋白可能代表了一類新的免疫抑制劑結合蛋白：15-DSG結合蛋白。15-DSG可與Hsp70s、Hsp90s發生特異性結合，而且DSG與它的結構類似物的免疫抑制劑活性和它們與熱休克蛋白的親和力有關，但具體作用機制至今還不清楚。不同的熱休克蛋白可與不同的免疫抑制劑發生結合，因此，熱休克蛋白可能為新的免疫抑制藥物提供了靶子。

　　已經證實當人受到細菌和寄生蟲感染時，這些病原體來源的熱休克蛋白一種非常重要的抗原。到目前為止，已經報道了有24種感染性疾病的免疫應答是針對熱休克蛋白，如結核病、麻風病等，其中對Hsp60s的免疫應答最多。熱休克蛋白能作為免疫系統識別的重要抗原的原因有兩個：一是當病原體被巨噬細胞吞噬時，它表達高水平的熱休克蛋白；二是在不同的病原菌中，熱休克蛋白是高度保守的，因此免疫系統可很方便地識別這些高度保守的分子。事實證明Hsp60s在許多感染中都是一免疫優勢抗原，它與細胞有免疫交叉活性，而且與一些自身免疫性疾病如IDDM有關。將來的研究將有助于闡明Hsp60s在自身免疫性疾病的作用，并可導致以Hsp60s為基礎的針對某些自身免疫性疾病的免疫治療方法的發展。

　　最近熱休克蛋白作為一種可增強肽或多糖免疫原性的佐劑已引起人們的重視。雖然這種載體效應會因可能引起對自身熱休克蛋白發生免疫答而冒一定的風險，但是它為疫苗的開發提供了一種新的思路。

　　熱休克蛋白參與了多種生物和免疫應簽過程，而且在許多疾病治療方面有很大的潛力。用一些化學物質或一些其他的方法來誘導產生熱休克蛋白，會使生物體對一些破壞性的刺激產生一定的抗性。因而對于一些患有慢性疾病，如糖尿病，心臟病或腎臟疾病的人可以考慮通過誘導其體內的Hsps的產生來加以治療。最近Vigh等利用一種新的細胞保護性的羥胺衍生物來誘導。而且熱休克蛋白也因此可被用作抵抗心血管和神經損傷疾病的有效手段。在器官保存和移植方面，熱休克蛋白也有一定的應用價值。雖然熱休克蛋白的應用有事實上的風險，但它在治療癌癥以及自身免疫性疾病方面有很大的潛力，隨著對熱休克蛋白調節機制的進一步了解，熱休克蛋白的應用一定會越來越廣泛。